Bilirubinometry
Zdroj: http://www.mujweb.cz/www/pantagruel/osobni/bilirubin/index.htm
1.0 Úvod
Bilirubin je konečným produktem při odstraňování železa z těla. Podstatnou měrou je produktem rozkladu erytrocytů - hemolýzy, menší měrou pak produktem rozkladu hemoproteinů. K hemolýze může docházet obecně kdekoliv v krevním řečišti, i když fyziologickým jevem je pouze hemolýza starých erytrocytů v játrech a brzlíku.
Bilirubin je látka pro organismus toxická, jeho zvýšená hladina, hyperbilirubinéme, je až na jedinnou vyjímku jevem patologickým a hrozí poškození organismu, zejména jater a nervových buněk. Normální hladina celkového bilirubinu se pohybuje okolo 17 mmol/l. Při jejím překročení se objevuje charakteistické žluté zbarvení pacienta - ikterus.
obr.1 - játra podle Gray´s anatomy
2.0 Fyziologie
Největší množství železa je v těle vázáno v erytrocytech, a proto se zaměřím pouze na katabolismus hemoglobinu a vědomě tím zanedbám katabolismus ostatních hemoproteinů, např. myoglobinu, jehož funkcí je uvolňovat ve svalech při zátěži kyslík.
obr.2 - Odbourávání železa
Hemoglobin je látka, která je složena ze čtyř částí bílkovinné povahy, z nichž kažká obsahuje vázanou jednu molekulu hemu. Dvojmocné želelo, které je vázáno ve struktuře hemu, je schopno na sebe navázat kyslík v plicích, kde je ho nadbytek, ale vazba je natolik slabá, že je kyslík uvolňován ve tkáních, kde je ho nedostatek, a putuje po konceentračním spádu. Vznikající oxid uhličitý je mnohel lépe rozpustný v krvi, a proto není nutné, aby krví putoval navázán na přenašeč.
Průměrná délka života erytrocytu je 120 dní. Po uplynutí této doby jsou staré erytrocyty vychytávány a rozkládáni speciálními buňkami v játrech a v brzlíku. Hemoglobin uvolněný při lýze buňky je rozložen ma hem a globin. Odstranění globinu nečiní organismu žádné potíže, protože se jedná o bílkovinu. Hem patří chemicky mezi porfyriny. Nejprve je ve své struktuře oxidačně štěpen. Meziproduktem této reakce je biliverdin. Bilirubin vzniká redukčním působením NADPH+H+. Mezi hlavní nepříjemné vlastnosti bilirubinu patří, že není rozpustný ve vodě, ale je rozpustný v tucích. Díky své nerozpustnosti ve vodě jej není organismus schopen vyloučit močí. Díky své rozpustnosti v tucích se velmi dobře rozpouští v buněčných membrámách a v buňkách obsahujcích tuk, což je právě příčinou jeho toxicity. Jeho odstranění z těla musí tedy probíhat jinou cestou. Pro snížení toxicity je nejprve volný bilirubin navázán na albumin. Vzniklý komplex bilirubin-bílkovina má mnohem lepší vlastnosti a je tedy možné jej transportovat do jater. V játrech je odstraněn nyní již zbytečný albumin a volný bilirubin je transportovám do hepatocytů (jaterních buněk). Tam pak reaguje s kyselinou glukurnovou, čímž vznikají dvě modifikace ve vodě rozpustného bilirubinu - bilirubin diglukurnoid (kunjugovaný) a bilirubin monoglukurnoid (nekonjugovaný). Malá část takto vzniklého bilirubinu uniká do plasmy, většina je ale vyloučena do žluči a s ní putuje do střev. Ve střevech je působením střevních baktérií přeněn na urobilinogen, ten může být dále redukován na sterkobilinogen. Následnou dehydrogenací pak vznikají urobilin a sterkobilin. Tyto látky se svým zbarvením podílejí podstatnou měrou na zbarvení stolice. Ze střev jsou v malé míře resorbovány zpět do krve. Z té jsou pak odváděny do jater, kde jsou částečně metabilizovány. Poté jsou vyloučeny přes ledniny do moči. Proto se podílejí i na zbarvení moči.
obr.4 - Konjugovaný a nekojnugovaný bilirubin
| Pohlaví |
Věk od |
Věk do |
Dolní RH |
Horní RH |
Poznámka |
| F + M |
0 |
|
1 |
D |
5 |
85 |
|
| F + M |
1 |
D |
15 |
R |
5 |
18 |
|
| F + M |
15 |
R |
99 |
R |
5 |
21 |
|
Koncentrace jsou uváděny v mmol/l
tab.1 - referenční hodnoty celkového bilirubinu
| Pohlaví |
Věk od |
Věk do |
Dolní RH |
Horní RH |
Poznámka |
| F + M |
0 |
|
99 |
R |
1,0 |
6,8 |
|
Koncentrace jsou uváděny v mmol/l
tab.2 - referenční hodnoty přímého bilirubinu
3.0 Patologie
Horní limit celkového bilirubinu se pohybuje okolo 17 mmol/l. Zvýšená hladina bilirubinu v krvi se nazývá hyperbilitubinémie. Do hladiny 25 mmol/l se stav pacienta nazýva subikterus - žluté zbarvení je patrné pouze na sliznicích a sklérách, při překročení i této hladiny se stav pacienta nazývá ikterus - žluté zbarvení je patrné i na pokožce. Podle lokace příčiny přebytku bilirubinu lze rozlišit tři formy ikteru :
- ikterus prehepatální : je překročena schopnost jater bilirubin konjugovat a vylučovat
- ikterus interahepatální : je porušena schopnost transportu bilirubinu z plasmy do hepatocytu nebo je porušena schopnost jater konjugovat
- ikterus posthepatální : je porušena schopnost vylučovat konjugovaný bilirubin hepatocytem nebo je porucha ve vylučování žlučový kyselin
Podle podílu konjugovaného a nekonjugovaného bilirubinu lze rozdělit hyperbilirubinémie na :
- nekonjugované : podíl konjugovaného bilirubinu je menší než 20%
- konjugované (převážně konjugované) : podíl konjugovaného bilirubinu je větší než 20%
Nutnost rychlé a včasné diagnózy a zahájení léčby je zvláště naléhavá u konjugované hyperbilirubinémie, protože zde hrozí vznik nevratných poškození jater. Obecně platí, že čím je hladina bilirubinu vyšší, tím je onemocnění závažnější. Na yřeteli je ale nutno mít fakt, že některé i velmi vážné choroby jater nejsou ikterem provázeny. Například častý anikterický průběh onemocnění lze pozorovat u hepatitidy B.
I. Převážně nekonjugovaná hyperbilirubinémie (premikrosomální typ)
A. Nadprodukce bilirubinu
1. hemolýza
2. inefektivní erytropoéza
B. Snížené vychytávání
C. Poruchy konjugace
1. fyziologická žloutenka novorozenců
2. žloutenka nedonošených
3. žloutenka Gilbertova typu
4. Crieglerův-Najjarův syndrom
5. získané poruchy - inhibice léky
|
II. Převážně konjugovaná hyperbilirubinémie (postmikrosomální typ)
A. Poruchy jaterní exkrece (hepatocelulární typ)
1. nemoci s primárním poškozením hepatocytů - hepatitidy, cirhóza
2. intrahepatální cholestáza - léky, těhotenství, idiopatická benigní cholestáza
3. benigní pooperační žloutenka
4. kongenitální konjugované hyperbilirubinémie - syndromy Dubin-Johnsonův a Rotorův
B. Obstrukce žlučových cest
1. intrahepatální obstrukce - sklerozující cholangitida, primární biliární cirhóza
2. extrahepatální obstrukce - kámen, nádor, striktura
|
tab.3 - rozdělení hyperbilirubinémií podle příčin
Bylo by na místě se zmínit o jedinné možné fyziologické příčině ikteru. Jedná se o lehkou žloutenku novorozenců. Její příčina tkví v tom, že plod má v krvi mnohem větší množství erytrocytů, něž jaké potřebuje novorozenec. Proto také začne organismus novorozence odbourávat přebytečné erytrocyty. Vzniká ale takové množství bilirubinu, že ještě ne zcela funkční játra nejsou schopny ho všechen zpracovat. Pro diagnózu lehké žloutekny novorozenců musí být splněny následující podnínky :
- ikterus se neobjeví dříve něž 36 hodin po porodu
- celkový bilirubin nepřesáhne 210 mmol/l
- ikterus netrvá déle než 8 dní
- konjugovaný bilirubin nepřesáhne 20% celkového
V případě nesplnění těchto podnínek se již jedné o zdraví ohrožující stav, například o těžkou žloutenku novorozenců způsobenou inkompatibilitou Rh systému matky a dítěte, kdy se v krvi dítěte objeví protilátky proti jeho vlastním erytrocytům.
4.0 Měření bilirubinu
Bilirubin se obvykle měří celkový, tj. součet konjugovaného i nekonjugovaného, a přímý, tj. konjugovaný. Pro změření obou hodnot se obvykle odebírá 5ml žilní krve, pro měření pouze jedné složky stačí 3ml krve. Do krve se přidá určitá reagencie, která zviditelní požadovanou složku ve spektrálním analyzátoru. Reagencie má obvykle stejné jméno jako látka, která se s její pomocí určuje. Na trhu se tedy běžně vyskytují reagencie "přímý bilirubin" a "celkový bilirubin".
Princip stanovení celkového bilirubinu
Stabilizovaná diazoniová sůl, diazo-tetrafluorborát 3,5-dichlorfenylu (DPD) reaguje s(konjugovaným a nekonjugovaným) bilirubinem v přítomnosti akcelerátoru a vytváří Azobilirubin. Absorbance při 540 nm je úměrná koncentraci celkového bilirubinu.
Princip stanovení přímého bilirubinu
Stabilizovaná diazoniová sůl, diazo-tetrafluorborát 3,5-dichlorfenylu (DPD) reaguje přímo s přímým (konjugovaným) bilirubinem v kyselém prostředí a vytváří Azobilirubin. Absorbance při 570 nm je úměrná koncentraci přímého bilirubinu.
Výše uvedená metoda je velmi rozšířená, ale má některé nevýhody. Především jde o metodu biochemickou, vyšetření krve provádí specializované pracoviště. K lékaři se tak mohou výsledky vyšetření dostat s velkým časovým zpožděním. S oddělením lékaře od laboratoře souvisí i riziko drastické chyby měření. Bilirubin je totiž fotocitlivá látka, na světle se rozkládá. Při neodborné manipulaci během přepravy tak může dojít k ozáření vzorku a následnému rozkladu bilirubinu. Výše uvedená metoda je velmi těžko použitelná v neonatální medicíně, protože odběr krve u novorozenců je problematický.
Moderní alternativou je měření hladiny bilirubinu neinvazivní cestou. Měření spočívá na spektrální analýze krve pod pokožkou pacienta. Tato metoda je určena především pro orientační měření. Běžná chyba této metody se pohybuje kolem 20 mmol/l. Pro neonatální medicínu bude ale přístroj jistě velkým přínosem, neboť umožňuje kontrolovat hladinu bilirubinu operativně.
5.0 Principy měřicích metod
Užítí chromatografických analyzátorů pro určování hladiny bilirubinu se ukázalo jako příliš náočné, takže obě výše uvedené metody jsou založeny na spektroskopii.
Základem spektroskopu je zdroj monochromatického záření. Paprsek je veden ze zdroje na polopropustné zrcadlo. Jeden ze vzniklých paprsků je použit jako referenční, druhý je ovlivněn vzorkem. Paprsek ovlivněný vzorkem i paprsek referenční jsou pomocí detektorů přecedeny na elektrický signál. Tyto siglály jsou pak poděleny, čímž lze celkem úspěšně korigovat chybu, která by vznikala časovou a frekvenční nestabilitou zdroje záření. Podle uspořádání bloku "vzorek" lze v nejzákladnějším pohledu rozlišit spektrometrii absorpční, kdy je měřen paprsek prošlý vzorkem, a spekrtoskopii reflexní, kdy je měřen paprsek odražený od vzorku, který bývá obvykle nanesen v tenké vrstvě na reflexním filmu. Absorbčí spektroskopie je užita v obvyklých analyzátorech, měření na odraženém paprsku ve využito u neinvazivního bilirubinometru.
Jako detektor se obvykle používá fotonka, fotonásobič, nebo diodové pole. Výhodou diodováho pole je, že je schopno pojmout naráz širší část záření, které je dispergováno, ale neprošlo příliš úzkou štěrbinou.
5.1 Invazivní metoda
Obvykle se používá zdroj záření, který nepracuje pouze ne jedinné frekvenci. Vzniklé záření je pak rozděleno pomocí disperzního prvku - optické mřížky, pouze vyjímečně optického hranolu, a výsledná frekvence je pak oddělena od ostatních pomocí štěrbiny. Zdrojem záření je pak obvykle žárovka s wolframovým vláknem a halogenovou atmoférou nebo deuteriová, rtuťová ,případně xenonová výbojka. U výbojek se ale vykytují některá omezení - xenonová výbojka je zdrojem velmi nestabilním a rtuťová výbojka poskytuje pouze čárové spektrum, září pouze na určitých vlnových délkách. Rozlišovací schopnost, které je definovéna jako poměr rozsahu vlnových délek zdroje ku rozsahu vlnových délek výstupního paprsku, býváu velni kvalitních zdrojů 106. Řádově 10x vyšší rozlišovací schopnosti lze dosáhnout při použití přeladitelných laserů, ale tento způsob je pro klinickou praxi zbytečne nákladný.
Přeladitelný laser využívá toho, že se mění energetické poměry v molekule při vystavení silnému vnějšímu elektrickému nebo magnetickému poli. Jestliže se změní vzdálenost základní hladiny a hladiny, na níž jsou exitovány elektrony, změní se i vlnová délka vyzařovaného záření. Běžně dosažitelná magnetická pole sice umožňují měnit vlnovou délku pouze v úzkém rozsahu, ale u polovodičových laserů, např. u laseru PbSnSe, lze měnit vlnové délky v poměrně širokém rozsahu. To umožňuje stavbu jakýchsi laserových barerií.
Pro velkou náročnost se systém přeladitelných laserů neujal, ale myšlenka laserových baterií je využita u některých typů analyzátorů - analyzátor provádí měření pouze na několika, např.7, diskrétních vlnových délkách. Výhodou takovýchto analyzátorů je podstatná redukce eletromechanických a optoelektrických prvků, čímž se zvyšuje i spolehlivost a přesnost. Na druhé strane však nelze takovýto přístroj použít pro ta měření, kde je třeba posoudit vzorek při více vlnových délkách.
5.2 Neinvazivní metoda
V ručním neinvazivním bilirubinometru je využito miniaturního spektrometru. Z pochopitelných důvadů nelze použít absorpčí spektroskopie, ale je nutné použít paprsku odraženého.
Velkou výhodou této metody je, jak bylo uvedeno již výše, její rychlost a operativnost nedosažitelná jakoukoliv laboratorní metodou. Její nevýhodou je nepříliš vysoká přesnost měření, uvádí se chyba okolo 20 mmol/l. Protože měření na odraženém paprsku poskytuje informace pouze o stavu v malé hloubce, je metoda omezena na použítí v neonatální medicíně. Přesto je to metoda, která jistě najde široké uplatnění, neboť umožňuje průběžně kontrolovat stav novorozence. Vždyť lehká žloutenka novorozenců se v různé míře objevuje až u 60% novorozenců. A zde je průběžná kontrola jistě na místě, zvláště pokud je novorozenec Rh inkompatibilní s matkou. Kdyby se totiž začal stav novorozence blíže zkoumat teprve poté, co jeho ikterus nevymizel po osmi dnech, mohlo by dojít k závažnému a v nepříznivých případech i ke s životem neslučitelnému poškození orgánů, nejčastěji jater.
obr.6 - pohled zhora na miniaturní spektrometr
výrobce - MicroParts steag GmbH
obr.7 a obr.8 - porovnání použití invazivní a neinvazivní metody měření hladiny bilirubinu v krvi novorozence. Z obrázku je zřejmé to, co není uvedeno v textu : měřicí přístroj se přikládá novorozenci na čelo. Pro korekci chyby se měření provádí pětkrát, než je známý konečný výsledek.
6.0 Ekonomické zhodnocení
Výše bylo sice naznačeno, ale nebylo uvedno přímo, že se bilirubinometr jako přístroj pro analýzu krve samostatně nevyrábí. Bylo by totiž velmi nehospodárné kupovat, a tedy i vyrádět, jednoúčelový přístroj, jehož pořizovací cena by byla srovnatelná s cenou levnějších přístrojů univerzálních. Provozní náklady jsou určeny především cenou reagencií. Ta ale není příliš vysolá, jedna dávka, tj. 100ml, přímého i celkového bilirubinu stojí shodně přibližně korunu.
U neinvazivních bilirubinometrů je již cena natolik nízká, že se vyplatí je konstruovat jako samostatné jednoúčelové přístroje. Tato nižší cena je ale vykoupena snížením přesnosti přístroje, ta je srovnatelná s maximální hladinou bilirubinu u zdravého jedince. Na druhou stranu tyto přístroje poskytují neocenitelnou výhodu v podobě operativnosti měření.
7.0 Seznam použité literatury
Tištěné zdroje
kolektiv : Lidské tělo, Gemini 1991
J.Nevoral, M.Elleder, J.Pachl : Onemocnění jater v dětském věku, Scientia Medica 1994
P.Engs, M.Horák : Aplikace laserů, SNTL 1989
Elektronické zdroje
Převzaté části dokumentu
Download jako EXE archiv